BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL Chemically Competent Cell 使用说明书

产品说明：

BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL菌株来源于Stratagene公司的BL21-Gold菌株，缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，从而减少对重组蛋白的降解，补充大肠杆菌缺乏的4种稀有密码子 (AGA, AUA, CCC, CUA)对应的tRNA (argU, ileY, proL, leuW)，提高外源基因，尤其是富含AT-或 GC-的真核基因在原核系统中的表达水平。该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区 (DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列、pGEX、pMAL等质粒的蛋白表达，同时具有四环素，氯霉素，链霉素，壮观霉素抗性。BL21- CodonPlus(DE3)-RIPL 感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/µg。

产品组成：

* 基因型：F^–ompT hsdS(r_B^–m_B^–) dcm⁺ Tet^R gal λ(DE3) endA Hte [argU proL Cam^R] [argU ileY leuW Strep/Spec^R] 

储存条件：

-80℃±10℃保存6个月。请勿将本品置于-20℃或液氮中保存。

使用方法：

1.       将感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰水浴中融化。

2.       将目的DNA（质粒或连接产物）加入到100μL感受态细胞中，轻轻弹匀，冰上孵育25分钟。

3.       42℃水浴热激45秒，立刻置于冰上，静置2～3分钟，晃动会降低转化效率。

4.       向离心管中加入200μL无抗LB、TB或SOC培养基，混匀后于220rpm，37℃摇床振荡复苏60分钟，使转化物表达抗性基因。

5.       根据实验要求吸取适量菌液，涂布至相应抗生素的2YT或LB培养基上，室温正置10分钟，待菌液被平板充分吸收后，37℃倒置过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)

1.       Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2.       Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃ overnight.

3.       Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4.       Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃ until the OD 600 reaches 0.5-0.8.

5.       (Optional)Pipet 1ml of  the cultures into clean microcentrifuge tubes and  place the tubes on ice until  needed  for gel analysis or storage at  -20℃. These will serve as the non-induced control samples. 

6.       Add IPTG to a final concentration of 1 mM.  Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

7.       Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃ for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.

8.       Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

9.       Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃ (storage at lower temperatures is also acceptable). 

IPTG

Prepare 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use. 

注意事项：

1.       感受态细胞冰水浴中缓慢融化。插入冰中8分钟内加入目的DNA，不可在冰上放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2.       待转化DNA加入体积不要超过感受态细胞体积的1/10。

3.       待转化DNA加入感受态细胞后，请勿用移液枪吹打，轻轻弹匀即可。

4.       为确保最高效率转化，整个操作过程应尽量轻柔，并保持冰上操作。

5.       转化高浓度的质粒或高效率的连接产物可相应减少最终用于涂板的菌量。

6.       为获得需要量的蛋白，最佳诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

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